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| Risk factors of DILI |
Risk factors
DILI的Risk factors可分為三個部分，分別是Host factors、Environmental factors以及Compound factors。
Host factors跟每個”個體”的基因及體內的代謝有關，與DILI有關的屬於多基因控制，不同的族群有不同的發生率，女性相對比男性發生率來的高，年紀越大發生率越大。Environmental factors包括感染及酒精的使用、或是有Virus co-infection，像是感染慢性B肝與C肝會增加DILI的發生機率。酒精與藥物共同使用 (Anti-TBs, antivirals, and antibiotics)也對於DILI的發生有Synergistic effect。Compound Factors與藥物本身的特性有關，其中最重要的是脂溶性藥物因為代謝途徑(Degradation pathway)較多較易造成DILI。
Classification
根據藥物對肝臟造成傷害的機轉，傳統上可以分成Intrinsic DILI以及Idiosyncratic DILI。Intrinsic DILI又稱為Direct DILI或Predictable DILI，Idiosyncratic DILI又稱為Unpredictable DILI。然而，在2019年的這篇Drug-Induced Liver Injury — Types and Phenotypes, Jay H. Hoofnagle, M.D., and Einar S. Björnsson, M.D., NEJM (2019)中，又從Idiosyncratic DILI中分出Indirect DILI這個分類，可能是因為近年來生物製劑以及免疫療法的崛起後所觀察到的一種最新分類。
Direct DILI跟藥物的特性有關，是藥物本質上對肝臟造成傷害，傷害是常見、可預測的，藥物超過一定劑量就會發生，onset time約在幾天內。Idiosyncratic DILI的發生則是不常見、隨機、不可預測，onset time可以從幾天到幾個月甚至到年。而Indirect DILI發生的機率介於前兩者之間，由於大多發生在同一類藥物，所以它是部分可預測，onset time多在使用後的幾周到幾個月的時間。
Mechanisms and Pathophysiology
肝臟其中一個重要的功能是藥物的代謝跟排除。若要瞭解藥物對肝臟造成傷害的機轉，要先瞭解藥物正常的代謝路徑。
六角形肝小葉的血流供應，是從Portal triad流經Sinusoid到Central vein。在經過Sinusoid時，Blood plasma會通過柵欄狀的Fenestrated sinusoid endothelium擠到Peri-sinusoidal Space of Dice，這個空間會與Hepatocyte的Basolateral membrane相鄰。
接著血漿中的藥物有兩個方式可進入肝細胞，一個是被動運輸，另一個是藉由Basolateral membrane側的Transport proteins進入Hepatocyte。
這些Transport proteins包括Solute carrier (SLC) family、Organic anion transporting polypeptide (OATP) superfamily、 Oganic anion transporter (OAT) family以及Organic cation transporter (OCT) family。我們的肝細胞表面有OATP1B1(encoded by SLCO1B1)、OATP1B3 (encoded by SLCO1B3)、OATP2B1 (encoded by SLCO2B1)等這類的Transporters。
藥物在肝臟中的代謝與排除有3個phase
Phase I metabolism：Oxidation
藉著Cytochrome P450 (藥物若由CYP2C9, CYP1A2 and CYP3A4代謝的話更容易造成Hepatotoxicity)酵素將藥物氧化成有活性的氧化代謝物(Reactive oxidative metabolites)，與細胞中的蛋白共價結合後會形成Drug-protein adduct，進而抑制蛋白質的功能，並對細胞內的胞器造成壓力(Cellular organelle stress)。
Phase II metabolism：Conjugation
將前面藥物的代謝產物與Glucuronic acid、sulfate或glutathione等內生性物質做Conjugation，被Conjugation後的藥物更具極性並且失去藥物的活性。
這些藥物代謝物的排出有兩條路可走，一部份的藥物經由Apical membrane上的Transporter從Bile canaliculi排到膽汁，而另一部份則走Basolateral membrane的Transporter回到Sinusoid的血液中，經由腎臟做後續排除。這些主要是藉由ATP-binding cassette (ABC) transporters出肝細胞，例如Multidrug resistance protein 1 (MDR1)，又叫做P-glycoprotein (encoded by ABCB1) anion exchange mechanisms。而Phase III metabolism就跟藥物排出肝細胞有關。
Phase III metabolism：Efflux process
藥物藉由ATP-dependent efflux pump (例如: MDR )排出肝細胞。
*而藥物對肝臟造成傷害的機轉跟抑制進入或出肝細胞的Transporters有關。
**另一個，若抑制藥物代謝產物流出肝細胞會讓這些有毒性的代謝物累積在肝細胞中。
Ex. 若是兩種藥物都是藉由同個Transporter被uptake入肝細胞，此時如果同時使用這兩種藥物，相對的uptake入肝臟的藥物就會減少，故使藥物在肝臟的排除變慢並且藥物的血清濃度會相對增加。舉例來說，像Statins(會經OATP1B1進入肝臟)與會抑制OATP1B1的藥物併用(如Cyclosporine A或Gemfibrozil)會使Statins的血清濃度增加，故造成Myopathy的機率會增加。另外，像是Pazopanib (TKI)是strong OATP1B1 inhibitor，但它是經由OCT1 uptake入肝細胞，但仍被認為可能造成Hepatotoxicity。
導致DILI的機轉可以分為三大類
1. Phase I代謝產生的Reactive metabolites，與細胞中的蛋白質共價結合後會形成Drug-protein adduct，會讓原本蛋白質的失去功能，並對細胞內的胞器(Mitochondria or ER proteins)造成壓力(Cellular organelle stress)。有一些Reactive metabolites則形成半抗原(Immunogenic haptens, neoantigen)而造成免疫反應產生DILI。
Ex: NSAID(Diclofenac)在經過Phase I代謝後會形成Reactive quinone imines及Acyl glucuronides而造成肝毒性。Troglitazone及lumiracoxib也是因會形成Reactive quinone產生致命肝毒性而退出市場。
2. 抑制用來排出膽汁的Bile salt export pump (BSEP, MDR3......)，讓藥物跟Bile堆積在肝細胞中，肝細胞內的bile salts濃度會上升造成Mitochondria damage(Cellular stress)導致肝細胞壞死。在有些證據上，這類抑制BSEP的藥物更容易造成Idiosyncratic DILI，故假設可能因為Intrahepatic bile acids累積會造成Cellular stress。此外，Intrahepatic bile acids累積也會藉由Death receptor或Ligand與細胞結合造成細胞Apoptosis。
節錄原文：
Bile acid-induced stress can also lead to increased targeting of death receptors (such as TNF- R and FasR) to the plasma membrane and sensitize the cell to ligand (such as TNF or FasL)-induced apoptosis or necrosis, or can induce ligand-independent activation of death receptors.
Ex. Bosentan(PAH)及Cyclosporin A是強力的BSEP抑制藥物，會造成Cholestasis。
關於膽汁淤積這件事……
Multidrug resistance gene product 3 (MDR3, encoded by ABCB4)失去功能會與Cholestasis有關。
MDR3的功能是把Phosphatidylcholine(磷脂醯膽鹼)從脂雙層裡面移到外面。
Phospholipids (磷脂)是膽汁中重要的成分，可以將膽固醇溶成Phospholipid–cholesterol vesicles。磷脂可以讓Bile acids維持膠體粒子的狀態，被認為可以保護膽管細胞(Cholangiocytes)。為何能保護膽管細胞呢？因為裸露的Bile acids會讓Cholangiocytes受損、造成Cholestatic or mixed injuries。
Ex. MDR3會被像是Itraconazole等抑制，導致被排到膽汁中的磷脂減少。
此外，Cholangiocytes或是小膽管受損會影響膽汁排出的順暢性，這些親脂性的產物會在肝細胞中堆積，最終導致Cholestatic liver injury。
Ex. 抗黴菌的-azoles類藥物，會抑制BSEP和MDR3，故易造成DILI。
3. Genetic variants: 像是ABCG2 Genetic variants會讓ABCG2 transporter的活性下降，造成Sunitinib在細胞中累積導致肝細胞傷害。
總結造成DILI的機轉，經常是一開始先有細胞內的Mechanism(例如前述的抑制BSEP及產生對胞器的壓力)，再加上後來合併有免疫學的傷害。
Intrinsic DILI及Idiosyncratic DILI的分子生物學觀點
Intrinsic DILI指的是原藥物或其Reactive metabolite的Toxic stress直接造成肝細胞的死亡(Necrosis or apoptosis)。主要的原因是產生氧化還原壓力、對內質網的壓力、造成粒線體失去功能或DNA損傷。
會造成DILI的藥物大部分是親脂性藥物(Lipophilic drugs)，這些藥物被代謝成Reactive metabolite，接著會Target在立線體或內質網的蛋白質(共價結合)而造成Cellular organelle stress (Mitochondrial or ER stress)。
若遇到這個壓力，在細胞正常調適的狀況下會自然地促進胞器產生Organelle specific adaptive responses來代償，所以不會吃啥都造成DILI。那要怎麼代償呢？他會藉著Redox-activated transcription factors (例如Nrf2)刺激Gene regulatory programmes，即增加chaperone proteins以對抗胞器中的Misfolding或Antioxidant response。
但若是這個Adaptive responses出問題，會因為粒線體失去功能(內外膜的通透性增加，就像是膜被打洞，例如APAP)、Necrosis或是活化Regulated cell-death pathways造成肝細胞死亡。
*另外其他Programmed cell necrosis mechanisms理論上也會導致DILI，像是necroptosis or pyroptosis
**The regulated cell-death pathways: Intrinsic stress會活化Pore-forming proteins, Bcl family (Bax, Bak and Bid)及Initiator caspases(Ex. Caspase 8)在粒線體的外膜打洞，造成釋放Cytochrome c，這可以活化Executioner caspases(Ex. Caspase 3, Caspase 7)及apoptosis。
Intrinsic DILI主要走先天免疫反應(Innate immune responses)這條路徑
Organelle stress或死掉的肝細胞會釋放IL-1, IL-6, TNF等cytokines或DAMPs (Damage-associated molecular pattern)如HMGB1(High mobility group box 1 protein) or DNA，會活化Resident liver Kupffer cells, NK and NK T cells/Neutropjhil/的Toll-like receptor，造成Pro-inflammatory cytokines or chemokine的釋放(TNF, FasL, IL-1β, IL-8, IL-6 and CXCL10)，進而再活化Death receptors(Ex. TNF-R, FasR, DR5)。
在Intrinsic DILI中，這些發炎反應會加強細胞死亡，也會刺激免疫反應。藉由活化先天免疫，也就是CD8 cytotoxic T cells的活化，進一步造成細胞Necrosis及Apoptosis。
*Acetaminophen(APAP)中毒，大部分是造成Necrosis；其他藥物則不一定是necrosis或apoptosis。
**另外提一下近年來有個新東西，Regulated necrosis，包括Necroptosis, pyroptosis and ferroptosis。這不一定與DILI有關係，但可能跟Nonalcoholic steatohepatitis (NASH), Alcoholic steatohepatitis (ASH) and Autoimmune hepatitis (AIH)有關。(等未來研究吧……)
***另外一個可能造成DILI的病理推想是跟腸道菌叢(Gut microbiome)有關，這與藥物代謝的肝腸循環(Enterohepatic circulation)、藥物代謝的狀態、及先天免疫有關。
至於Idiosyncratic DILI簡單來說類似藥物過敏，與後天免疫反應(Adaptive immune response)有關
目前主流的證據顯示，Idiosyncratic DILI與個體的後天免疫反應有關。但先天免疫反應產生的一些訊號(像是半抗原)，也會加強Idiosyncratic DILI的後天免疫反應。
在藥物使用後造成Idiosyncratic DILI的時間點不定、但通常會延遲一段時間(六個月內)且是Not dose-independent。但目前發現主要都是發生在藥物的劑量大於50-100 mg/day。這個現象可能說明了活化免疫反應的閾值。所以說(也很直覺)，高劑量且是肝代謝的藥物較易造成DILI。
HLA polymorphism和Idiosyncratic DILI有關。帶有某種HLA variant的人會對特定藥物產生特定的Drug-adduct peptides，這些Phase I代謝產生的Reactive metabolites會跟胞器內的蛋白質結合生成半抗原(Haptens, Neoantigen)。
這些Haptens會活化後天免疫系統(CD4+ T cell)造成明顯的肝臟損傷，藉由抗原抗體反應造成肝細胞死亡。少數藥物會直接結合在肝細胞上的MHC class I或T cell receptor上活化T cell response，另一部分的藥物及其代謝物則會改變MHC binding groove導致Misdirected peptite presentation。
雖然說HLA types貌似能決定藥物所造成的免疫反應，但研究發現一些帶有特殊HLA haplotype的人卻沒對這些特定的藥物產生DILI，推測與Immune tolerance有關。因此可以說HLA types不全然是造成Idiosyncratic DILI的原因，其中還摻雜了其他原因(只是現在還沒找到)。所以說Idiosyncratic DILI與基因以及環境因子有關。
Immune activation跟Immune tolerance的拉鋸與Indirect DILI
Immune tolerance(免疫耐受)是指免疫系統對特定抗原不會產生反應。這種免疫豁免是肝臟本來自帶的強大特性，自體的反應性淋巴球無法接觸到位於免疫屏障中的自身抗原。
原本Immune activation跟Immune tolerance互相拉鋸達到平衡，身體就相安無事。但有些可以打破Immune tolerance的抗癌藥物(主要就是Immune checkpoint inhibitors, ICIs)跟生物製劑會消除掉肝臟的免疫豁免(Immune privilege)這層屏障，故會對肝臟造成Autoimmune-like的急性傷害。這類藥物若使用超過劑量的閾值就會造成Indirect DILI。
Adaptation
當然臨床在走，總有些大觀察家發現一些有趣的現象。像是有些使用藥物後，會有微微的肝指數上升但不停藥繼續使用後肝指數卻慢慢回到正常，這現象被稱作Adaptation。
這是個假說，Adaptation可以阻止剛開始發生的Toxic stress或是Immune tolerance的形成而阻止肝臟進一部受到傷害。Adaptation在肝臟受傷後還沒有表現出Signs/Symptoms前就已經開始(在肝指數升高之前)。
但若是Adaptation失敗而打破Immune tolerance，則天秤失衡會造成肝臟全面性的傷害。
後記：這些DILI的機轉實在是太分子生物學了，對習慣臨床的我來說真的非常困難。看了第二遍怕以後忘記要重練，還是把它寫下來當作是讀書筆記了。
Reference:
1. Drug-Induced Liver Injury, Raul J. Andrade, Nature Reviews Disease Primers (2019)
2. Drug-Induced Liver Injury — Types and Phenotypes, Jay H. Hoofnagle, M.D., and Einar S. Björnsson, M.D., NEJM (2019)
3. Drug-Induced Liver Injury, Leslie A. Hamilton; Angela Collins-Yoder; Rachel E. Collins, AACN Adv Crit Care (2016)
4. In Silico Prediction of DILI Based on Ensemble Classifier Method. Yangyang Wang, Int. J. Mol. Sci. (2019)
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